ゲノム イン プリンティング。 Research ─ 研究を通して ─:ゲノムインプリンティングとホ乳類の進化

3Dバイオプリンティング

ゲノム イン プリンティング

国立大学法人九州大学 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 九州大学大学院医学研究院医化学分野の梅山大地学術研究員(現:理化学研究所)と伊藤隆司教授は、細胞内におけるタンパク質-DNA相互作用の全体像を捉える新しい方法を開発しました。 私たちの身体を形成している様々な細胞は、基本的に同一のゲノムDNAを持っていますが、ゲノム中の遺伝子を取捨選択して使うことによって、それぞれの個性を発揮したり環境変化に適応したりしています。 したがって、ゲノムの働き方を包括的に理解するには、ゲノムDNA上のタンパク質結合部位を網羅的に明らかにする必要があります。 そのために、細胞から単離した核にDNA切断酵素を働かせる方法が用いられています。 しかし、これらの方法は、操作が煩雑な上に、核を単離する過程でDNAとタンパク質の相互作用が失われる危険性も有しています。 これに対して、梅山博士と伊藤教授は、ジメチル硫酸(DMS)という細胞膜を通過してDNAをメチル化する化合物に着目しました。 DMS-seqと命名されたこの方法によって、核を単離せずに細胞内におけるタンパク質-DNA相互作用の全体像を明らかにすることが、初めて可能になりました。 DMS-seqは、様々な分野の研究を基礎から支える技術になることが期待されます。 本成果は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)の革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ「エピゲノム研究に基づく診断・治療へ向けた新技術の創出」研究開発領域における研究課題「ヒト消化器上皮細胞の標準エピゲノム解析と解析技術開発」(研究開発代表者:金井弥栄)および文部科学省科学研究費補助金によるもので2017年10月3日(火)12時(米国東部標準時[夏時間])に、国際学術雑誌「Cell Reports」のオンライン版に掲載されました。 ゲノムの働き方を包括的に理解するには、転写因子やヒストン等がゲノムDNA上のどこに結合しているのかを網羅的に明らかにする必要があります。 しかし、ChIP-seqは転写因子毎に解析する方法なので、解析すべき転写因子が予め分かっていないと使えませんし、それが明らかな場合でもその転写因子の結合部位しか知ることが出来ません。 したがって、解析すべき転写因子が不明な場合や想定外の転写因子の関与も見落とさないためには、あらゆるタンパク質の結合部位を検出できるゲノムフットプリンティングというアプローチが必要になります。 ゲノムフットプリンティングでは、それぞれの部位に結合しているタンパク質の正体までは分かりません。 しかし、その部分のDNA配列から結合タンパク質を予測できることもあり、その場合にはChIP-seqを用いて予測を検証することも可能です。 従来、ゲノムフットプリンティングには、細胞から単離した核に対してDNA分解酵素を働かせる方法が用いられてきました。 しかし、これらの方法は、操作自体の難易度が高く、そもそも核を単離する過程でDNAとタンパク質の相互作用が変化或いは喪失する危険性もあるため、新しい方法の開発が求められていました。 内容 我々は、核を取り出さずに、簡便かつ細胞内の状態をより正確に反映した形でゲノムフットプリンティングを行うため、ジメチル硫酸 DMS に着目しました。 DMSを2本鎖DNAに作用させるとグアニン(G)とアデニン(A)をメチル化しますが、タンパク質が結合している部位のGとAはメチル化を免れます。 したがって、タンパク質結合部位をメチル化されない部分(フットプリント)として検出することが可能です。 DMSは細胞膜を通過するので、培地にDMSを添加するだけで核内のゲノムDNAがメチル化されます。 つまり、DMSは試験管内(in vitro)のみならず生体内(in vivo)でのフットプリンティングにも利用できます。 実際、DMSによる in vivoフットプリンティングは、目的遺伝子領域をPCRで増幅する形で行われてきました。 しかしながら、DMSで処理した細胞では、ゲノムDNA全体にフットプリントが形成されている訳ですから、その一部をPCRで取り出すのではなく、全部を次世代シーケンサで読み出すDMS-seqが成功すれば、核の単離を必要としない簡便でしかもin vivoの状態をより忠実に反映したゲノムフットプリンティングが実現する筈です。 そこで我々は、出芽酵母をモデルにDMS-seqの開発に取り組みました。 その結果、期待通りに転写因子の結合部位を検出できることが判りました。 例えば、転写因子Abf1が結合しそうな配列(結合モチーフ)の周辺にはin vivoでDMS-seqのピークが検出され(図1A)、DMSフットプリントとして検出されたものはChIP-seqピークとして検出されたものとよく一致しました(図1B)。 また、転写の開始点と終結点の近傍に存在することが最近注目されている非定型的なクロマチン粒子も検出できました。 更に、定型的なクロマチン粒子であるヌクレオソームについては、その中心座標に対してDMSが高親和性を示すという予想外の発見がありました(図1C)。 ヌクレオソームの両端近傍を検出するMNase-seqとは切断点の分布が完全に逆位相を示します。 従来、ヌクレオソームの中心座標を直接的に決定するにはヒストン遺伝子群の改変に基づく化学的切断法しか手段がなく、この方法が適用できる生物はヒストン遺伝子の数が例外的に少ない生物に限定されていました。 これに対して、DMS-seqは、遺伝子操作を必要としませんので、原理的にはヒトを含むあらゆる真核生物においてヌクレオソームの中心座標の決定に応用可能な初めての方法となりました。 DMS-seqは転写因子結合を検出できる。 転写因子Abf1の結合モチーフ周辺にはin vivoでのみDMS-seqのシグナルがピークを形成する。 DMS-seqとChIP-seqの結果はよく一致する。 DMSフットプリントとして検出されたAbf1結合モチーフはChIP-seqピークとして検出されたものと有意に重なる。 DMSはヌクレオソーム中心を優先的に切断する。 DMS-seqによる切断点の分布は、ヌクレオソーム中心を検出する化学切断法による切断点の分布と一致する一方、ヌクレオソームの両端周辺を切断する酵素マイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)による切断点の分布とはちょうど逆位相の関係を示す。 今後の展開 今回の成果は、DMS-seqがゲノムフットプリンティングに利用可能であることと、既存手法にはないユニークさを持つことを示したものです。 DMS-seqの実用性向上には更なる改良が必要ですし、データ解釈には既存ChIP-seqデータとの統合解析も重要になります。 また、細胞内でヌクレオソーム中心となるDNAがタンパク質と結合していない状態でもDMS感受性を示すことも判明し、この事実が示唆するDNA形状とヌクレオソーム配置の関係の解明も期待されます。 こうして、細胞内におけるタンパク質-DNA相互作用の全体像が明らかになるにつれて、細胞の増殖分化や環境応答の仕組みの包括的な理解も深まってゆくでしょう。 そして、その異常として疾患や病態を捉え直すことは、治療や予防を考える上においても重要な視点となることが期待されます。 kyushu-u. kyushu-u.

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Restriction Enzymes in Genome Mapping and Analysis

ゲノム イン プリンティング

ゲノムインプリンティング 〜インプリンティングの機構 には各世代の発生過程で起こるインプリンティングのサイクルを模式的にしめした。 インプリンティングを受ける染色体領域または遺伝子は、配偶子形成(gametogenesis)過程で精子 父親 由来か卵子 母親 由来かの「しるし=インプリント(imprint)」を刷り込まれる。 このインプリントの違いは受精を経て、同一の核に入っても維持され、さらに複製・細胞分裂を繰り返しても消失しない。 そして体細胞ではインプリントにしたがって父性または母性対立遺伝子特異的な発現が起こる。 一方生殖系列では始原生殖細胞で一旦インプリントの消去が起こり、つづいて配偶子形成過程で新たなインプリントの獲得が起こる。 インプリンティングのサイクルは、DNA配列に変化を与えないエピジェネティックな機構で回転する。 そのような機構の代表はDNAメチル化(DNAmethylation)である。 CpGに相補的な配列はやはりCpGであるから、2本鎖DNAは両鎖にメチル化の標的をもつ。 そのうちDnmt1と呼ばれるメチルトランスフェラーゼは主に体細胞で発現し、一方の鎖がメチル化されたヘミメチル化(hemimethylated)CpGを優先的に認識し、相補鎖上のシトシンをメチル化する 維持メチル化、maintenance methylation。 この酵素の活性により、哺乳類の体細胞はDNA複製を経て同じメチル化状態を維持できる。 またDNAメチル化が遺伝子発現の制御機構として働くことは、X染色体の不活性化をはじめ多くの例が示すとおりである。 インプリンティング遺伝子のメチル化状態を調べると、実際に父性・母性対立遺伝子の間に差が見られる。 さらにDnmt1をノックアウトしたマウスの体細胞で、3つの遺伝子のインプリンティングが変化したことから、メチル化のインプリンティングへの関与が明確になった。 DNAメチル化はヒストン蛋白質の修飾などのエピジェネティックな機構と協調してインプリンティングを制御すると考えられている。 図3:インプリンティングのサイクルを示した模式図。 ここでは精子 父親 由来か卵子 母親 由来かのインプリントを異なるパターン 色 で示す。 図4:シトシンのメチル化 左 と維持メチル化 右。 佐々木裕之:「現代医学の基礎第5巻,生殖と発生」(岩波書店)第9章に加筆(文責:佐々木裕之).

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細胞内におけるタンパク質―DNA相互作用の全体像を捉える新しい方法を開発

ゲノム イン プリンティング

ゲノム刷り込みと疾患 [ ] 一方の親から受け継いだ遺伝子だけが選択的に発現することは、利用できる遺伝子が一つしかないため受け継いだ遺伝子に欠陥があった場合にそのバックアップがなく、流産または遺伝子疾患になってしまうことがある。 よく知られた例がであり、15番染色体にある遺伝子(セロトニン受容体かその近傍の遺伝子と考えられる)が父親由来の遺伝子のみが選択的に発現するため、父親の遺伝子に欠陥があった場合に(母親が正常な遺伝子をもっていても)、正常な個体発生ができなくなり、精神遅滞や生殖器の発生異常等の障害をもって産まれる。 ゲノム刷り込みの必要性 [ ] 上記のような問題点があるにもかかわらず、なぜゲノム刷り込みが必要であるか(なぜ哺乳類に備わっているか)については、いくつかの仮説が唱えられている。 (外部リンク参照。 ) 仮説の一つとして、「単為発生を防ぐため」というものがある。 この仮説のように「これこれのため」という目的説の妥当性は別として、ゲノム刷り込みがあるせいで哺乳類では単為発生が起こらないことは事実である。 仮説の一つとして、「全ての遺伝子を発現させるためだ」というものがある。 この仮説に従えば、哺乳類のように高度に発達した生物に進化するには、ゲノム刷り込みが必要だったことになる。 逆に言えば、ゲノム刷り込みがあったからこそ、哺乳類は(部分的に発現しない遺伝子をもって個体発生が成功するような危険を冒さずに)高度な個体組織をもつように進化できたことになる。 ゲノム刷り込みは、個体発生や胎盤形成と密接な関係があることもわかってきた。 なお、ゲノム刷り込みが起こるのは、有袋類と有胎盤類である。 単孔類は違う。 また、有袋類と有胎盤類のあいだで、ゲノム刷り込みの機構は大きく進化した。 ゲノム刷り込みの機構 [ ] ゲノム刷り込みは的な表現ではによる調節 異常 [ ]とされている。 その機構はほぼ解明されているが、非常に複雑である。 (外部リンクを参照。 ) 配列自体には明らかな特徴がないため全中でどの程度の遺伝子がこの作用をうけているのかは分かっておらず、現在知られているものはほぼ全て偶然発見された遺伝子である。 外部リンク [ ]• , (本項の記述は、かなり多くをこれに依拠している。 - 遺伝学電子博物館、 この項目は、に関連した です。 などしてくださる(/)。

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